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    盤點ELISA測定操作技術要求
    點擊次數:1063 更新時間:2022-11-25

    ELISA即酶聯吸附試驗,是一種常用的固相酶免疫測定方法。ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術要求,下面盤點ELISA測定操作技術要求如下:

     

    1、嚴格按照試劑說明書進行操作。

     

    2、檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時,洗滌液應現用現配,同時觀察濃縮洗滌液中有無結晶,若有結晶應放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB時應注意有無顏色變化,若已顯色則可能過期或變質,也不可使用。

     

    3、加樣后及時放入孵育箱。標本較多時,要分批操作。按照說明書步驟嚴格控制操作時間,防止孵育時間人為延長,導致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗*

     

    4、封板溫育時,各孔一定要封嚴,防止陽性標本的液體蒸發,不會引起孔間的污染,產生周邊現象從而導致“花板“的出現。

     

    5、應保證酶標版清潔,整個操作過程中保證酶標版不接觸次氯酸。

     

    6、加酶試劑后用吸水紙在酶標版表面輕拭吸干。

     

    7、合理安排檢測量,以免反應板過多造成洗板等待時間長。

     

    8、手動洗板時,加洗液要快速,沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配制,以免被其他試劑污染,或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板,選用無粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板,使孔內沒有可見液體掛壁;但也不能太重,不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續的加液。

     

    9、用洗板機洗板時,保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完版后在吸水紙(選擇干凈,無塵的吸水材料)上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶,將堵塞洗板機針孔,造成全堵或半堵狀態,以致使未結合的酶標記物不能*洗脫,而使最后底物顯色時加深,造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿后應及時清空,以防止廢液回流對管道的污染,而使洗滌不*,造成花板。洗板結束后應用蒸餾水*清洗管道,以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數及加液量不可*按照試劑說明書設定,應根據本實驗室的實際情況來設定,開展新項目前,應做好驗證工作,根據洗滌的效果來決定洗滌的次數和加液量。同時應根據儀器維護保養程序,定期對洗板機進行維護保養。

     

    10、加樣量的準確與否,直接影響抗原抗體結合物的濃度,直至最后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深,若插入太深,吸嘴外壁可能粘連太多血清,輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中,造成交叉污染。加樣時應盡可能的垂直加樣,并加在包被孔的底部,不可加在孔的上部。標本量大時,可考慮使用排槍加試劑,可提高速度,但使用排槍時應注意吸嘴一定要裝好,不可松動,否則會影響加樣量的準確度。加樣時保持顯色劑不外流,顯色劑應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡。

     

    11、加樣時間間隔對結果也有一定的影響,在競爭抑制法試驗中,理論上應該是標本與酶標抗體混合后同時加入反應孔,若標本先于酶標抗體加入反應孔,則標本會先與包被抗體進行反應,造成特異性假陽性。若是有干擾物質存在時表現明顯,在公平條件下,干擾物質與包被抗體的結合能力會低于標本,而在非公平條件下,干擾物質會優先與包被抗體進行結合,出現假陽性。做HBcAb項目時,若標本與酶加樣時間間隔太長,會引起吸光度的趨勢性變化,會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標本,出現假陽性。

     

    12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時,應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質量的超純水或雙蒸水,電導率小于1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解后配制。配制后要測定其pH值,使其范圍在7.2-7.4之間。

     

     

     

     

     

     


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