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    細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)具體操作說(shuō)明
    點(diǎn)擊次數(shù):799 更新時(shí)間:2024-05-27

            細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程,分為間期與分裂期兩個(gè)階段。如下圖:


    QQ截圖20240527144035.jpg

    G0期:這一期的細(xì)胞稱(chēng)為休眠細(xì)胞,細(xì)胞暫時(shí)脫離分裂周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開(kāi)始DNA合成, 進(jìn)行細(xì)胞分裂。

    G1 期:主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和碳水化合物。

    S期:這個(gè)時(shí)期主要合成DNA, 同時(shí)還會(huì)合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時(shí)期合成。

    G2期:DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。

    M期:RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 染色體高度螺旋化。

    細(xì)胞周期檢測(cè)的原理:

    PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法,PI是碘化丙啶(Propidium),一種雙鏈DNA的熒光染料,碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光,并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定,然后根據(jù)DNA含量的分布情況,可進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。

    通常正常細(xì)胞的G0/ G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細(xì)胞用冰乙醇固定通透后,PI可以與細(xì)胞的DNA結(jié)合,其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。

    因此,可以通過(guò)流式細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè),將細(xì)胞周期區(qū)分為G1/G0 期,S 期和G2/M 期,并可得出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

    細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程:

    收集細(xì)胞:A: 收集細(xì)胞5~20×105于離心管中,若細(xì)胞比較小(如淋巴細(xì)胞)400 g離心,若細(xì)胞比較大(如腫瘤細(xì)胞)300 g離心,5~10 min,棄去培養(yǎng)液;

    洗滌:加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次,離心棄去上清;

    固定前處理:利用管底殘留的液體,輕彈管底,將沉淀重懸成細(xì)胞懸液,避免細(xì)胞成團(tuán);

    細(xì)胞固定:加入約1 ml -20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇中,輕輕吹打混勻,-20℃固定1 h或過(guò)夜;

    洗滌:加入1 ml冷PBS(提前放4℃預(yù)冷)洗滌1次,300 g離心10min,棄去上清;

    RNA酶消化:300 g 離心 5 min,吸盡上清后,加入 100 μL 的 RNase A 并充分懸浮細(xì)胞,37°C 水浴 30 min。

    PI染色:加入400μL的PI溶液并充分混勻,4℃避光孵育30 min;

    上機(jī)檢測(cè):用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光,低速獲取細(xì)胞,采用分析軟件進(jìn)行DNA含量分析。

    細(xì)胞周期檢測(cè)注意事項(xiàng):

    1、培養(yǎng)細(xì)胞注意無(wú)菌環(huán)境。

    2、染液等物質(zhì)有一定毒性,注意防護(hù)。

    3、本實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)所需收集細(xì)胞量較多,收集細(xì)胞時(shí)盡量多收集一些。

    4、本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞離心,重懸次數(shù)較多,注意動(dòng)作輕緩,避免過(guò)多地?fù)p傷細(xì)胞。

    5、固定時(shí)必須預(yù)冷PBS重懸打入無(wú)水乙醇中,二者順序不可顛倒。

    6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),以對(duì)數(shù)期處理為宜,避免細(xì)胞量過(guò)少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞開(kāi)始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。

    7、固定后細(xì)胞雖然可以保存較長(zhǎng)時(shí)間后再上機(jī)檢測(cè),為避免不可控因素影響最好及早上機(jī)檢測(cè)。


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