甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)

商品屬性：

Fpg (formamidopyrimidine [fapy]-DNAglycosylase，甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶）也稱作8-氧代niao嘌呤 DNA 糖基化酶，既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下雙鏈DNA 上受損的嘌呤堿基，產生一個脫嘌呤（AP）位點。
AP-裂解酶活性可以切割 AP 位點的 3′ 或 5′ 端，因此可以除去 AP 位點，產生一個具有 3′ 和 5′ 磷酸的堿基缺口。被 Fpg 識別并切除的受損堿基包括：7,8-二羥基-8-氧代niao嘌呤（8-氧代niao嘌呤）、8-羥基腺嘌呤、fapyniao嘌呤、甲基-fapy-niao嘌呤、fapy-腺嘌呤、黃曲霉毒素B1-fapy-niao嘌呤、5-羥基-胞嘧啶和 5-羥基niao嘧啶。

活性定義：1 單位指在 10 μl 反應體系中，37℃條件下，1 小時內能夠切割 1 pmol 含單個與胞嘧啶配對的 8-氧代niao嘌呤的 34 bp 寡核苷酸雙鏈所需要的酶量定義為一個活性單位。
熱失活：60°C，10min。
反應條件：10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10 mM MgCl2 ，1mMDTT, 100 μg/ml BSA，37℃ 溫育。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復凍融。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

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