公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：血清血漿 miRNA 提取試劑盒是目前提取小 RNA（<200nt）操作步驟簡(jiǎn)單、重復(fù)性最好、小 RNA 產(chǎn) 率最高的方法之一。使用該試劑盒通過一步上柱即可獲得高 純度 miRNA，可在 10min 左右完成小 RNA 的提取；且使用 該試劑盒提取的小 RNA（Small RNA）中，長(zhǎng)度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA，可 直接用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、Northern 雜交、測(cè)序等應(yīng)用。

儲(chǔ)存：室溫可保存 2 年。
使用防護(hù)建議：Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍鹽，其具有強(qiáng)烈的腐蝕性，試驗(yàn)時(shí)請(qǐng)務(wù)必佩戴防護(hù)眼鏡、手套、口罩等防護(hù)措施，如有皮膚接觸請(qǐng)立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。
自備試劑：異丙醇、乙醇、75%異丙醇、2ml EP 管
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。將 300μl 血清或血漿樣本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中，用腕力混勻 30s,室溫放置 5min。
(2) 13,000rpm 離心5min，將上清約 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 異丙醇，上下顛倒混合均勻。
(3) 將上述溶液分三次加至吸附柱中（每次約 700μl），13,000rpm 離心 15s，倒掉過柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。
(7) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree H2O，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產(chǎn)物即為提取的 miRNA。
常見問題匯總：
(1) 由于血清血漿中的 miRNA 含量極低，提取的 miRNA 濃度通常在 5 ng/μl 以下，因此難以用常規(guī)的 NanoDrop 測(cè)量濃度，建議直接使用 10 μl 進(jìn)行下游反轉(zhuǎn)錄。由于本試劑盒提取的是小 RNA，該濃度下的 miRNA Copy 數(shù)足以進(jìn)行下游檢測(cè)。
(2) 由于血清血漿中 miRNA 的含量低，為了獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議使用特異性和靈敏度更好的 TaqMan 探針法進(jìn)行 miRNA 的下游檢測(cè)。本試劑盒提取的 miRNA 并不限于其它檢測(cè)方法和用途，包括 SYBR Green 法檢測(cè)、二代測(cè)序、芯片等檢測(cè)領(lǐng)域。
(3) 血清血漿 TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為血清血漿專用，不可用于細(xì)胞和組織的 miRNA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：