原因一：競賽抑制比較顯著，應稀釋競賽物；

　　原因二：以下降非特異性反響，使特異性的抗原抗體反響充分體現出來。血清稀釋用一般的PBS即可，可加1％的BSA，能有用下降ELISA本底，當然假如你嫌費事我覺得用生理鹽水代替PBS關系也不大。不論你是用直接競賽仍是直接競賽，血清的稀釋倍數肯定要事前斷定，但也不必一點點，你做一個預試驗即可，挑選OD在1.0左右的稀釋倍數，即你的競賽ELISA中陰性孔OD在1.0，這樣作出來的曲線比較敏感。

　　ELISA試劑盒試驗稀釋血清的過程：

　　先把蛋白稀釋必定的倍數，比如說10倍、20倍稀釋（這樣能夠大體斷定一個參數），將抗原進行一系列稀釋包被微量反響板，再用必定稀釋度的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷，再加酶結合物進行反響，經孵育洗刷后，加底物溶液顯色，停止反響后別離測定O.D值，挑選O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要挑選那個O.D值稍大于1.0，而不挑選小于1.0的抗原濃度。陰性參閱血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值有顯著不同。

　　除此之外，ELISA試驗中還會遇到各種各樣的問題，作為實驗者需要及時找出處理的方法，包括：

　　1、洗板：1）采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉；2）反應板過多造成洗板等待時間長；

　　3）采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導致洗板不*；洗板針堵塞，抽吸不*；洗板不暢，導致洗板效果差。

　　解決方法：1）保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干；2）合理安排，或多用幾臺洗板機。

　　2、顯色：1）加顯色劑時濺出孔外造成液體回流；2）顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑。

　　解決方法：1）加樣時保持顯色劑不外流；2）顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。

　　3、終止：可能原因如加終止液時產生較多氣泡，導致假陽性增加。所以在加終止液時應避免產生氣泡。

　　4、讀板：如讀板時板底不清潔等。應保證酶標板清潔。所以在整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸；盡可能實現ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質量。