原因一：競(jìng)賽抑制比較顯著，應(yīng)稀釋競(jìng)賽物；

　　原因二：以下降非特異性反響，使特異性的抗原抗體反響充分體現(xiàn)出來(lái)。血清稀釋用一般的PBS即可，可加1％的BSA，能有用下降ELISA本底，當(dāng)然假如你嫌費(fèi)事我覺(jué)得用生理鹽水代替PBS關(guān)系也不大。不論你是用直接競(jìng)賽仍是直接競(jìng)賽，血清的稀釋倍數(shù)肯定要事前斷定，但也不必一點(diǎn)點(diǎn)，你做一個(gè)預(yù)試驗(yàn)即可，挑選OD在1.0左右的稀釋倍數(shù)，即你的競(jìng)賽ELISA中陰性孔OD在1.0，這樣作出來(lái)的曲線比較敏感。

　　ELISA試劑盒試驗(yàn)稀釋血清的過(guò)程：

　　先把蛋白稀釋必定的倍數(shù)，比如說(shuō)10倍、20倍稀釋（這樣能夠大體斷定一個(gè)參數(shù)），將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反響板，再用必定稀釋度的陽(yáng)性參閱血清和陰性參閱血清進(jìn)行孵育后洗刷，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反響，經(jīng)孵育洗刷后，加底物溶液顯色，停止反響后別離測(cè)定O.D值，挑選O.D值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要挑選那個(gè)O.D值稍大于1.0，而不挑選小于1.0的抗原濃度。陰性參閱血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值有顯著不同。

　　除此之外，ELISA試驗(yàn)中還會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題，作為實(shí)驗(yàn)者需要及時(shí)找出處理的方法，包括：

　　1、洗板：1）采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉；2）反應(yīng)板過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(zhǎng)；

　　3）采用半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不*；洗板針堵塞，抽吸不*；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。

　　解決方法：1）保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無(wú)或少塵的吸水材料)上輕輕拍干；2）合理安排，或多用幾臺(tái)洗板機(jī)。

　　2、顯色：1）加顯色劑時(shí)濺出孔外造成液體回流；2）顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或使用過(guò)期顯色劑。

　　解決方法：1）加樣時(shí)保持顯色劑不外流；2）顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑，肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。

　　3、終止：可能原因如加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽(yáng)性增加。所以在加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

　　4、讀板：如讀板時(shí)板底不清潔等。應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。所以在整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸；盡可能實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化，有效提高檢測(cè)質(zhì)量。